Весьма необычно для творчества Рафаэля то, что картина написана на холсте. Рафаэль, в отличие от своих современников начала XVI века, которые перешли на работу по холсту, предпочитал традиционную деревянную основу. Наиболее простое объяснение: для картины столь большого размера удобнее использовать холст. Однако известна картина Тициана «Ассунта» в Венеции, намного больше по размеру, (690 × 360 см) написанная на нескольких, соединённых вместе досках. К. Ф. фон Румор предположил, что картину Рафаэля, помимо алтарного образа, планировалось использовать как хоругвь — в качестве знамени для религиозных процессий. Другая гипотеза заключается в том, что картина была написана для гробницы папы Юлия II (Джулиано делла Ровере), поскольку святой Сикст был небесным покровителем папы Сикста IV и всей семьи. Папа Юлий II скончался 21 февраля 1513 года. Святая Варвара Илиопольская, изображённая на картине, почитается как защитница от внезапной смерти и утешительница в последний час. Ангелы в нижней части картины, согласно этой версии, интерпретируются в качестве гениев смерти. Данное предположение подтверждает то, что жёлуди на казуле (одеянии) Святого Сикста явно отсылают к двум папам из рода делла Ровере (итал. rovere — дуб). На том, что картина предназначалась именно для траурной церемонии, настаивает немецкий востоковед и историк культуры Хуберт Гримме. Он задался вопросом: откуда взялась деревянная планка у нижнего края картины, на которую опираются два ангелочка? (на ней стоит папская тиара). Следующий вопрос: каким образом получилось, что такому художнику, как Рафаэль, пришло в голову использовать столь «театральный приём» — обрамить небо портьерами? Исследователь убеждён, что заказ на «Сикстинскую мадонну» был получен в связи с установлением гроба для торжественного прощания с папой Сикстом IV. Тело папы было выставлено для прощания в боковом приделе собора Святого Петра в Ватикане. Картина Рафаэля была установлена на гробе в нише этого придела. Рафаэль изобразил, как из глубины этой обрамлённой зелёными портьерами ниши Мадонна в облаках приближается к гробу папы. Некоторое время спустя картина оказалась на главном алтаре монастырской церкви в Пьяченце. Основанием для «ссылки» стало литургическое правило, которое запрещает использовать на главном алтаре изображения, выставлявшиеся в траурных церемониях. Творение Рафаэля из-за этого запрета в какой-то степени потеряло свою ценность. Чтобы получить за картину соответствующую цену, папской курии ничего не оставалось, как дать своё молчаливое согласие на помещение картины в алтаре церкви далёкого провинциального города. Согласно другой гипотезе Марилен Путчер (1955) картина была заказана и разработана специально для главного алтаря церкви в Пьяченце, построенной в те же годы, и должна была имитировать окно в центре апсиды.

В XVIII веке распространилась легенда (не подтверждённая историческими документами), что моделью для Мадонны стала возлюбленная Рафаэля, семнадцатилетняя дочь пекаря Маргарита Лути. Рафаэль назвал её Форнарина (от итал. fornaro — пекарь). Прообразом святого Сикста послужил сам папа Юлий (племянник Сикста IV), а для святой Варвары — его племянница Джулия Орсини. Сходство с папой отмечали Дж. Б. Кавальказелле и многие другие, а в качестве прототипа святой Варвары также упоминалось имя Лукреции делла Ровере, другой племянницы понтифика.

Ещё одна деталь: изобразительная криптограмма. Святой Сикст изображён Рафаэлем с шестью пальцами на правой руке, поскольку он «Сикст» (лат. sextus — шестой). На самом деле кажущийся шестой палец (мизинец) является частью внутренней стороны ладони. Картина единодушно считается одним из величайших шедевров западного искусства по многим причинам, прежде всего из-за скрытой за кажущейся простотой изображения символической сложности композиции и гармоничной контаминации греко-римского, почти языческого, идеала красоты и христианского религиозного чувства. Отчуждение картины от священного места, для которого она была написана (монастырь Сан-Систо в Пьяченце), и её перенос в мирскую картинную галерею вызывали у интеллектуалов XVIII века глубокие размышления о возможностях «моленного образа» выдающегося художественного свойства изменять свои функции применительно к любой среде восприятия.

Композиция картины отражает длительную эволюцию индивидуального мышления художника. В «ранних Мадоннах» Рафаэль писал миловидных девушек на фоне типично умбрийского пейзажа. В картине Мадонна Грандука он заменил пейзажный фон нейтрально-тёмным, почти чёрным, представив Деву Марию фронтально, стоящей, с Младенцем на руках, и заключил изображение в строгий вертикальный формат. Затем, весьма неожиданно, Рафаэль как бы вернулся назад, к иератическим композициям Средневековья, в частности, к византийскому типу Одигитрии. Помимо этого художник разрабатывал живописный образ Мадонны в небесах. Такова его картина «Мадонна ди Фолиньо» (1511—1512) — непосредственная предшественница «Сикстинской».